聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction PCR)是一種體外擴(kuò)增特異性DNA片段的技術(shù)。它可以在體外特異地對(duì)目的基因進(jìn)行大量擴(kuò)增，其巧妙之處在預(yù)先設(shè)計(jì)合成二段分別與待測(cè)目的基因二端互補(bǔ)的引物，以起到指向定點(diǎn)的作用；再借助于DNA聚合酶催化的若干次擴(kuò)增反應(yīng)后，即可使特定的基因片段成百萬(wàn)倍的擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)分三步：
①變性：當(dāng)通過(guò)加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA。
②褪火：當(dāng)溫度突然降低時(shí)由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜得多，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補(bǔ)的機(jī)會(huì)較少。
③延伸：在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物，以及Mg2+存在的條件下，
以引物為起始點(diǎn)，從5′→3′催化的DNA鏈延伸反應(yīng)。
以上3步為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一循環(huán)的模板，若干次循環(huán)之后，介于兩個(gè)引物之間的特異性DNA片段就得到了大量的復(fù)制，數(shù)量可達(dá)2×107～8拷貝，PCR的實(shí)驗(yàn)操作包括模板DNA(或RNA)的制備、引物的設(shè)計(jì)合成、酶促聚合反應(yīng)、反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)等。
操作步驟
(一)模板DNA(靶序列)的制備
進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板可以是人體組織細(xì)胞的染色體DNA，微生物的DNA，或是由mRNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA等。本實(shí)驗(yàn)用小鼠肝臟制備染色體DNA作為PCR擴(kuò)增的模板。
1. 取肝組織0.5g加入2ml裂解液。
2. 冰浴勻漿。
3. 取勻漿液200μl加入裂解液200μl。
4. 加入蛋白酶k至終末濃度為100μg/ml。
5. 以上溶液在65℃保溫?cái)?shù)小時(shí)或過(guò)一夜，不時(shí)震搖。
6. 加入75μl 8M KAC，混勻。
7. 在4℃放置15分鐘。
8. 加入750μl氯仿。
9. 經(jīng)充分震搖后5 000rpm、離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)入一新的Eppenderf管，沉淀?xiàng)壢ァ?br />10. 加入750μl無(wú)水乙醇，充分混勻，-20℃靜置30分鐘。
11. 12 000rpm、離心10分鐘，棄去上清，沉淀用500μl 70%乙醇洗一次，10 000rpm、再離心5分鐘，棄去上清，于室溫將有DNA沉淀的Eppendorf管敞開15～30分鐘，使痕量乙醇揮發(fā)。
12. 將DNA沉淀團(tuán)塊溶于100μl TE緩沖液，加RNA酶1μl，在37℃水浴放置30分鐘。
13. 用等體積的酚/氯仿抽提一次。
14. 取上清，加入1/10體積的NaAc(pH4.8)和2倍體積的無(wú)水乙醇，混勻。
15. 12 000rpm、離心10分鐘，棄去上清，沉淀用500μl 70%乙醇洗一次，10 000rpm，再離心5分鐘，棄去上清，于室溫將有DNA沉淀的Eppendorf管敞開15～30分鐘，使痕量乙醇揮發(fā)。溶于50μl TE。
16. 取1μl樣品用500μl雙蒸水稀釋，在260nm和280nm處測(cè)定吸光度。鑒定樣品純度并計(jì)算其含量。
17. 將DNA溶液保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>